浅议遗传学遗传学实验中SSR标记运用实践

摘 要：该实验是科研成果转化为实验教学设计的一个成功案例，建立了植物DNA指纹检测和父本鉴定技术。通过本实验，学生可以掌握PCR技术、DNA提取和电泳检测等实验技术，巩固关于基因位点/等位基因、纯合体/杂合体、二倍体/三倍体摘自：毕业论文摘要www.618jyw.com
、孟德尔遗传规律和DNA指纹图谱等多个（对）重要的遗传学概念，提高学生学习遗传学的兴趣。
关键词：遗传标记 遗传学实验 SSR 枣树 分子遗传
Application and practice of SSR marker in the teaching of genetics experiment
Pang Xiaoming， Li Yingyue
Beijing forestry university， Beijing， 100083， China
Abstract： The well-designed experiment is a succesul case of making full use of scientific research achievements in the teaching of genetic experiment， which includes the experiment of DNA fingerprinting construction and paternity analysis of the seedlings. Through the experiment， the students will he the experience of PCR technology， DNA isolation and the separation of DNA by different methods. Furthermore， the involvement in the experiment will help to strengthen several important concepts in the genetics including gene locus/allele， heterozygosity/homozygosity， diploid/triploid， the Mendelian inheritance laws and DNA fingerprinting etc. Taken together， the experiment will be important to invoke the interest to learn the course for the students.
Key words： genetic marker； genetic experiment； SSR； jujube； molecular genetics
“DNA指纹”是指可以利用DNA差异来进行与传统指纹相似的个体身份识别。DNA指纹是以DNA的多态性为基础。SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列），又称微卫星DNA，一般是由2～6个核苷酸碱基组成的基序并串联而成的DNA序列，在真核生物基因组中广泛存在。SSR标记具有多态性高、实验操作简单、稳定性好、可重复性高、对DNA模板质量和数量要求均较低的共显性标记，现广泛应用于亲本分析、遗传多样性研究、指纹图谱和遗传图谱构建等方面，是一种目前发展较为成熟的分子标记技术。
在植物的遗传及育种试验和实践中（如实生选种中），获得的子代苗母本来源是确切知道的，但经常缺乏父本信息。利用共显性分子标记技术结合统计分析方法可以帮助我们寻找可能的父本来源。父本分析（Paternity analysis）对了解群体间或世代间的基因流动及性别选择适合度有重要的理论意义。SSR的高分辨力及其共显性遗传特点使其成为杂交种亲本鉴定使用最多的标记。
常用的父本分析方法包括排除分析法、最大似然性分析法和父性拆分法等，在植物群体中利用亲本排除法进行父本分析的例子较多。排除分析法根据孟德尔遗传规律检测母本与可疑父本基因型组合能否产生子代基因型，否则排除相应可疑父本。另外，也可以利用软件Cervus 3.0进行分析。Cervus 3.0是一款使用共显性标记的软件，是Marshall于1998年开发的，这款软件可以鉴定单亲本未知或双亲本未知的情况，基于最大似然法进行亲本分析，通过等位基因频率来计算各个非排除父本作为亲生父本的概率，进而确定最大可能的父本。用LOD值来进行结果分析。由于便于操作，是目前最普遍应用的亲本分析软件[3]。
该实验是体现遗传学原理和技术在生产和生活中应用的例子，可达到巩固和学习如下重要知识点的目的：（1）通过提取枣树DNA，熟悉植物DNA的提取步骤；（2）巩固分离定律和自由组合定律的学习；（3）巩固PCR技术原理；（4）通过SSR标记的检测，掌握SSR标记的原理、检测技术和应用；（5）通过二倍体和多倍体基因型差异，巩固复等位基因和基因座等概念；（6）学习利用SSR标记进行亲子鉴定的原理和技术。学生通过实验了解到遗传学技术和理论知识可解决生产生活中的具体问题，可有效调动学生学习遗传学知识和技术的兴趣和热情，有助于消除科学研究高不可攀的心理，激发学生对基本实验和科学研究的兴趣，增强学生分析问题和解决问题的能力。
1 实验材料及试剂

1.1 实验材料

冬枣、映山红、赞皇大枣（3n）、梨枣、柿饼枣和辣椒枣及6个不同的杂交后代基因型（已知母本为冬枣，假定父本未知）共12个基因型的植物材料。

1.2 实验试剂

PCR MIX（北京博迈德科技发展有限公司），6～8对SSR引物，琼脂糖，DNA分子量标准，ddH2O，溴酚蓝加样缓冲液，5×TBE浓贮液〔称取27.5 g硼酸与54 g Tris碱，称量20 ml EDTA（0.5 mol/L），加入蒸馏水定容至1 000 mL，待溶解后室温保存待用〕，使用时稀释为0.5×TBE，Goldviewer II（染液）等。 2 实验方法

2.1 实验仪器

微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，PCR仪，电泳仪，紫外透射仪，照相机或（国产凝胶成像系统），头和离心管（使用前高温灭菌）。

2.2 实验步骤

（1）DNA提取：从我校实验苗圃采集各植物材料叶片，对各样品进行准确编号记录，应用CTAB法或试剂盒法提取总DNA。
（2）DNA质量检测：取5μL DNA样品混合1μL 6×Loading Buffer，用0.5×TBE液配制0.8%琼脂糖凝胶对总DNA进行电泳质量检测；取3 μLDNA样品液，在超微量紫外分光光度计上测量其DNA含量（μg/mL）、A260 nm/A280 nm的值及其在260 nm处的吸收峰，摘自：本科毕业论文答辩www.618jyw.com
检测DNA的纯度，对DNA进行稀释，直至工作浓度10 ng/μL。
（3）SSR-PCR扩增：应用6对SSR引物（见表1）进行PCR反应[4]，引物由北京金唯智生物公司合成。荧光引物为M13（-21）-ROX：TGTAAA ACGACGGCCAGT。
表1 SSR引物信息表
20.0 μL PCR反应体系包括：2×PCR MIX（10 μL）、DNA模板（1.0 μL），1?M上游引物（1.0 ul），1?M下游引物（1.0 μL）和ddH2O（7.0 μL）。如果采用毛细管测序电泳检测，则体系中加入1 ?M的M13引物3.2 μL。按上述体系混合好后，PCR程序设置如下：94℃ 5min；94℃ 30s-55℃（相应退火温度）30s-72℃ 45s，30个循环；94℃ 30s-53℃ 30s-72℃ 30s，8个循环；72℃ 10min；4℃ forever。
（4）扩增产物检测：扩增结果按照公司提供的手册进行ABI Pri 3730XL型测序仪测序检测，所得数据利用GeneMarker V1.75软件进行读取。或者采用4%琼脂糖凝胶电泳进行检测：用1×TBE液配制70 mL+3.5 μL Goldviewer II；每管加入5 μL溴酚蓝上样缓冲液，瞬时离心取10 μL扩增产物上样；稳压100V，电泳1～1.5 h；UVP凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。

2.3 分析结果

图示各品种的基因型，计算相关指标或采用软件分析确定子代的未知父本；当用于检验的位点间非连锁遗传时，每一个位点可以计算出一个父权指数PI（paternity index）值（疑似父亲获得父权的可能性与失去父权可能性的比值，也称为非父排除率），多位点的累积PI值（CPI）等于各位点PI值的乘积，计算公式为：CPI=PI1×PI2×PI3×…×PIn（1，2，3…n代表第1，2，3…n个位点的PI值）。由PI值得到的相对亲权概率RCP=[CPI/（CPI+1）]×100%≥99.73%时，可认为疑似亲本得到父权，RCP<99.73%时，可认为疑似亲本失去父权[5]。依据Cervus3.0软件说明，似然比值越大，鉴定结果的准确性越高。最终鉴定结果的准确度用LOD值的大小来衡量。LOD值为正值时，所鉴定出的亲本组合为真实亲本组合的概率大于非真实亲本组合，随着LOD值的不断增大，鉴定出真实亲本的可能性也随之增大。
3 实验结果
微卫星位点BFU0277的基因分型峰图如图1所示。分型结果理想，可以较为准确地判断等位基因大小。由图1可知赞皇大枣含三等位基因，验证的基三倍体的特点，其余样品为二倍体。二倍体样品中除梨枣是纯合体以外，其他样品为杂合体。对除赞皇大枣以外的其他个体共分析了8对SSR引物，每个个体的基因型见表2。从表2可以看出，11个个体在这8个基因座的基因型是不一样的，这也构成了区分这11个样品的SSR指纹图谱。
图1 12个样品在BFU0277号引物中的毛细管电泳检测图
表2 11个样品在8个基因座的SSR基因型
子代1～5的母本为冬枣，通过排除分析法，子代1～4不可能以柿饼枣、辣椒枣或梨枣为父本，因为SSR等位基因遗传违反孟德尔遗传规律，子代出现与这几个疑似亲本完全不同的等位基因位点，排除它们之间有亲缘关系。而映山红不能排除为父本。按照方法中所述公式计算CPI和RCP，结果见表3，可推测映山红为子代1～4的父本。对于子代5，所有的可能父本都被排除，因此在供选材料中没有子代5的父本。而子代6为双亲都未知的个体，通过排除法发现，供选亲本中没有合适的样本可能为其父母本。
表3 4个子代的父本分析指标
由Cervus 3.0软件分析发现，子代1～4的父本为映山红的LOD值见表3，4个LOD值都大于零，与RCP计算结果相一致。对于子代5，所有的可能父本的LOD值都为负值；对于子代6，各种父母本组合的LOD值均为负值。因此，与排除法所得的结果相一致，疑似亲本中没有这两个个体的父（母）本。
4 结束语
本实验为基于课题组最新的科学研究成果设计成的学生容易操作的实验内容，把与实践挂钩的亲子鉴定内容设计到实验中，可以增加学生的学习兴趣[6]。根据实验结果我们看到，本实验涉及基因位点/等位基因、纯合体/杂合体、二倍体/三倍体、孟德尔遗传规律和DNA指纹图谱等多个（对）重要的遗传学概念，使学生能形象地掌握相关概念。
根据学生专业和课时长短的不同，教师可以对实验内容有选择地进行。生物科学和技术类专业课时较长，可以选择用常规的CTAB方法进行DNA提取；而农业和林业等应用性专业学时相对较短，可采用试剂盒进行DNA提取，以节省时间。如果时间和实验经费允许，SSR的产物检测可采用毛细管电泳的方法。而凝胶电泳的方法相对便宜，时间短，而且可以更好地锻炼学生的动手操作能力，有利于学生在实验过程中自信心的培养。
参考文献
Cipriani G， Marrazzo ME， Gaspero G. A set of microsatellite markers with long core repeat optimized for grape （Vitis spp.） genotyping[J]. BMC Plant Biology，2008，8：127.
张冬梅，沈熙环，张华新.林木群体基因流及父本分析的研究进展[J].林业科学研究，2003，16（4）：488-494.
[3]Kalinowski， ST， Taper， ML & Marshall， TC. Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment[J]. Molecular Ecology，2007，16：1099-1106.
[4]王斯琪，唐诗哲，孔德仓.利用SSR标记进行枣树子代苗父本鉴定[J].园艺学报，2012，39（11）：2133-2140.
[5]杨庆恩.亲子鉴定DNA分型亲权指数的简化计算法[J].中国法医学杂志，1998，13（2）：90-92.
[6]夏曦中，车婧，章志宏.SSR分子标记技术在遗传学实验教学中的应用[J].实验技术与管理，2012，29（6）：48-50.