简析神经元乳鼠皮层神经元原代培养改良策略及基本电生理特性学生
更新时间：2024-01-28
点赞:13992
浏览:51358
作者：用户投稿
本站原创
摘 要：目的：对原有乳鼠大鼠皮层神经元的原代培养方法进行改进，获得高质量且体外存活时间更长的神经元，以期应用于对细胞功能状态要求高的相关研究。方法：多聚赖氨酸预处理培养皿，分离出生24 h之内的SD大鼠大脑皮层神经元，采用机械吹打与胰蛋白酶化学消化相结合的方法制备单细胞悬液，经计数后以1×105 / mL的细胞密度接种。24 h后加阿糖胞苷（3 μg/mL）以抑制非神经细胞过度增殖。培养3 d后将培养液全量换为添加B27的培养液。用倒置相差显微镜观察细胞形态，并用膜片钳单通道记录法记录BKCa通道电流。结果：对原有培养方法改进后获得可长期存活的形态典型神经元。在培养36 d时，用膜片钳单通道记录法仍能记录到正常的BKCa通道电流。结论：该培养方法简单，经济，结果稳定，可作为体外原代培养乳鼠神经元的良好实验模型。
关键词：原代培养；皮层神经元；乳鼠；膜片钳；BKCa通道电流
1007-3612（2012）10-0042-05
A Modified Method for Primary Culture of Newborn Rat Cortical Neurons and Its Basic Electrophysiological Property
ZHAO Li， CHEN Yao， GONG Lijing， LU Yuanyuan
（Beijing Sport University， Beijing 100084， China）
Abstract：Objective：To modify previous method of primary newborn rat cortical neuron culture to get purer and more longlasting cells for som摘自：毕业论文结论范文www.618jyw.com
e related studies. Methods：The cerebral cortices were aseptically removed from 024 hold SD rats and dissected out. Mechanical dissociation and trypsin digestion were combined to conduct monocell suspending media. The dissociated momocortical cells were diluted to 1×105/ml then to be plated on poly Llysinecoated petri dish. After 24h culture， 3μg/mL cytosine arabinoside （AraC） was added to the culture for 24 h to inhibit the outgrowth of glial cells. After three days postplanted， all media were removed from cultures and replaced with medium supplemented with B27. Then half of the culture medium was changed every three days. The morphological changes of neuron cells were observed by light microscope. Immunostaining of microtubuleassociated protein 2 （MAP2） was applied to assess the culture purity. Single channel current was recorded to evaluate the neurons properties by using patch clamp technique. Results： The improved method could increase the cells lifetime. On the 36th day， the primary culture was characterized by normal morphology and was gained typical BKca current. Conclusion：This is a simple and reliable technique for the in vitro primary culture of rat cortical neurons which he longtime livability and normal electrophysiological property.
Key words：primary culture， cortical neurons， newborn rat， patch clamp， BKca current
原代培养神经细胞的生长发育特征与在体神经元非常相似，且具有样本均一性高，实验条件可控、相对恒定，影响因素单一，可有效排除诸多复杂因素（如体内循环、体液、内分泌、血脑屏障）等优点，日益成为神经科学研究中必不可少的实验材料及模型工具[1，2]。然而神经细胞培养与其他类型的细胞培养不同，正常神经细胞只能增大而不能增殖，即只能原代培养，不能传代，没有细胞分裂现象，随着培养时间的延长，神经细胞数只会减少，不可能增加。目前一般认为培养2～4周进行实验比较适宜，4周后细胞就开始退化[3]。而作为研究细胞电生理特性的膜片钳技术既要保证细胞形态特征的完好，又要保存其生理学特征，才能供研究使用[4]。本研究结合相关文献，对原有的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法进行改进，并采用膜片钳内面向外模式记录大电导钙激活钾通道（BKca）单通道电流，旨在建立一种简单、经济、体外存活时间较长且电生理特性正常的大鼠皮层神经元原代培养方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物 新生（< 24 h） SD大鼠，SPF级，由军事医学科学院动物中心提供。
1.2 试剂与溶液 EGTA，HEPES，L 多聚赖氨酸、阿糖胞苷、胰蛋白酶为Sigma公司产品；B-27 Supplement为Gibco公司产品；高糖DMEM，青霉素，链霉素为Hyclone公司产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；其他药品均为国产分析纯。
解剖液（mM）：10 HEPES， 135 NaCl， 5 KCl， 1.3 Na2HPO4.12H2O， 0.2 KH2PO4， 8.8 glucose，105 sucrose， 调节pH 至7.3，0.22 μm孔径滤膜过滤。DMEM完全培养液：89%高糖DMEM，10%胎牛血清，1%双抗（青霉素 （100 U/mL） ，链霉素 （100 U/mL），经0.22 μm孔径滤膜过滤。谷氨酰胺在使用前加入到培养基，终浓度为2 mM。DMEM/B27完全培养液：87%高糖DMEM，10%胎牛血清，2% B-27 Supplement，1%双抗（青霉素 （100 U/mL） ，链霉素 （100 U/mL） ），经0.22 μm孔径滤膜过滤。谷氨酰胺在使用前加入到培养基，终浓度为2 mM。电极内液（mM）：100 KCl，2 CaCl2，10 HEPES，用NaOH调 节pH至7.2-7.4，充灌前经0.22 μm滤膜进行过滤。细胞外液（mM）：40 KCl，0.55 CaCl2，1 EGTA，10 HEPES和10 glucose，用KOH调 节pH至7.2～7.4。使用前经0.22 μm滤膜进行过滤。
1.3 培养皿的预处理 包被L多聚赖氨酸： 培养神经元采用直径为35 mm的一次性塑料培养皿（NUNC），在培养前用终浓度为50 Lg/ mL的L多聚赖氨酸包被培养皿，置于超净工作台内（打开皿盖），紫外灯下照射2 h，回收多余液体。干燥后用DMEM冲洗两遍备用。
1.4 培养方法 取出生后24 h的SD大鼠，用去离子水冲洗体表后，于75%医用酒精中消毒，3～5 s后取出，移入超净工作台，在无菌环境下迅速取大脑，置于预冷的解剖液中。分离得到双侧皮层，用眼科镊剔除脑膜及血管，剪碎后转移到离心管内，并加入10倍体积的消化液（消化液为0.25%胰蛋白酶及解剖液（1∶1）的混合液），37℃水浴。采用二次消化的方法：每隔5 min轻晃离心管，使组织块与胰蛋白酶充分接触，10 min后用口径适宜且管口光滑的吸管轻轻吹打十几次，静置，取上清液于另一离心管，用含血清的DMED完全培养液终止消化，经200目尼龙滤网过滤获得单细胞悬液。剩余组织块加入适量消化液重复上述步骤。单细胞悬液 1 000 转/min 离心10 min，倒去上清液后，加DMEM完全培养液重悬，台酚蓝染色计数后，以1×105 的细胞密度接种于培养皿中，每皿2 mL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后加一次阿糖胞苷（3 μg/mL）以抑制非神经细胞过度增殖。培养基改进组在培养3 d后全量换为DMEM/B27完全培养液，之后每隔3 d半量换液；传统培养基组每隔源于：毕业论文指导记录www.618jyw.com
3 d半量换DMEM完全培养液。倒置相差显微镜（IX71-F22PH，Olympus，Japan）定期观察培养过程中细胞的生长情况。传统培养基组的神经元在培养至6 d时进行单通道BKCa通道电流的记录。培养基改进组培养至36 d时进行单通道BKCa通道电流记录。
1.5 大鼠大脑皮质神经元的形态学观察 细胞接种后定期在倒置相差显微镜下观察神经元生长的情况，并应用MAP2和Cy3免疫荧光双标染色，鉴定本方法培养的神经元。
1.6 BKCa通道电流的记录 实验在室温（20～25℃）下进行，将培养皿置于倒置相差显微镜载物台中。记录所用电极为薄壁硼硅玻璃电极毛细微管 （B15014F，ID：1.05 mm，OD：1.50 mm；Vital Sense Scientific Instruments，Wuhan），用电极拉制仪（PC10，Narishige，Tokyo） 两步拉制，经抛光仪 （MF-830，Narishige，Tokyo）抛光，电极尖端直径约为1.5 μm。实验采用膜片钳内面向外模式进行单通道记录，细胞内外液采用对称性高K+（140 mM）方式。玻璃微电极充灌电极内液后电阻为4～8 MΩ，给予电极一定正压，用微操纵器控制电极入液。当电极尖端接触细胞表面时，缓慢给与负压，即可见应答电流下降直至为零，表明高阻封接形成。待封接稳定，阻抗达10 GΩ以上，将电极提出液面，在空气中暴露数秒，再入液，即形成内面向外记录膜片。电流信号经膜片钳放大器 [Multiclamp 700B，Axon（（MDC）] 放大，1～2 kHz低通滤波，经模数/数模转换器[Digidata-1440A，Axon（MDC）] ，由pClamp10记录、储存于计算机。采样模式为Gap free，采样频率为2 kHz，8-极Bessel滤波1～3 kHz。
1.7 数据处理与分析 单通道数据经Clampfit10.2分析程序自动测量通道平均电流幅度（Am）、开放概率（Po）、平均开放时间（To）和 平均关闭时间（Tc）。经统计软件对数据及曲线拟合等做统计处理。
数据以均数±标准差表示。统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析，差异显著性为P<0.05，非常显著性为P<0.01。
2 结 果
2.1 神经细胞形态学观察 倒置相差显微镜观察：接种后24 h，细胞已贴壁，胞体较小，呈圆形或椭圆形，折光性良好，分布均匀，有1～2个突起，但细胞间连接较少。经MAP2和Cy3免疫荧光双标染色呈强阳性，荧光显微镜观察本方法培养的神经元纯度高达95%（图1）。图1 MAP2标记阳性神经元
培养3 d，细胞胞体增大较快，呈梭形或三角锥形，细胞间已形成稀疏的网络（图2A，图2 a）。培养6 d，神经细胞胞体增大，突起粗而长，有单极、双极、多极突起，细胞胞体饱满，光晕明显，已形成完整神经网络（图2B，图2b）。可见两组细胞在接种后前6 d细胞形态无显著性差异，但随着培养时间的逐步延长，采用传统DMEM完全培养液的神经元，在同一时间点，胞体较培养基改进组小，
图2 体外原代培养新生大鼠大脑皮层神经元光镜照片 400×
注：A，B，C，D分别为培养基改进组3 d，6 d，20 d，36 d的神经元。 a，b，c，d分别为传统培养基组3 d，6 d，20 d，28 d的神经元。
突起短，细，神经网络形成不明显，细胞出现退行性改变的时间早。如在培养20 d时，传统培养基组神经元出现细胞聚集成团，摘自：毕业论文翻译www.618jyw.com
神经元胞体内颗粒增多，突起减少、缩短，神经纤维退化等现象（图2 c），而培养基改进组在培养20 d时，细胞仍具有良好的光晕，致密的神经网络布满皿底（图2 C），在培养至36 d以后，神经元才逐渐出现胞体折光性降低，突起减少、缩短等退行性变化（图2 D）。而采用传统DMEM完全培养液基的神经元在培养至28 d时，已找不到形态完整的细胞（图2 d）。
2.2 原代培养大鼠皮层神经元BKCa单通道电流特性 原代培养皮层神经元细胞膜上的单通道电活动表现出明显的电压依赖性。随膜电位去极化程度增大，单通道电流幅值增大，开放概率显著增加。在对称性高钾（140 mM）溶液中，浴液游离钙浓度为2 μM时，内面向外膜片下记录的典型单通道电流（图3）。对培养36 d的培养基改进组神经元6个膜片的单通道电流进行统计后，绘制IV曲线，获取较大电导值（G）为（248.5±5.12）pS，反转电位接近0 mV。对培养6 d的传统培养基组神经元6个膜片的单通道电流进行统计后，绘制IV曲线，获取较大电导值（G）为（222.2±7.94）pS，反转电位接近0 mV。两组神经元BKCa通道的电导值并无显著性差异（P>0.05），且均符合BKCa通道大电导的特性[5]。
图3 大鼠皮层神经元BKCa通道电压依赖性图（A，a）和电导特性图（B，b）
注：采用内面向外单通道记录模式。在对称性高钾（140 mM）溶液中，浴液游离钙浓度为2 μM，IV曲线经线性拟合。
图3A、B为培养36 d的培养基改进组神经元BKCa通道特性图，图3ab为培养6 d的传统培养基组神经元BKCa通道特性图。
对培养36 d的培养基改进组神经元BKCa通道进行药理学鉴定：内面向外记录模式下，浴液钙离子浓度为2 mM时，形成内面向外记录模式后，将膜电位钳于+40 mV下，记录10 min，观察通道开放情况。如图4A所示 ，形成内面向外模式之初，通道开放频率很高，加入60 mmol/L钾通道特异性阻断剂四乙胺（TEA）后，通道开放在5 min后基本被阻断（图4B）。这种电流能被胞内较高浓度的钾通道阻断剂TEA所阻断，表明该通道电流为钾电流。
图4 TEA对培养36 d的培养基改进组神经元 BKCa通道的阻断作用
注：采用内面向外单通道记录模式。膜电位钳为+40 mV，浴液钙离子浓度为2 mM。A为加入TEA之前，B为加入60 mmol/L的TEA后5 min记录的电流。
在膜电位为+40 mV时，当浴液中钙离子浓度由0.1 mM增加至2 mM时，培养36 d的培养基改进组神经元BKCa通道开放概率由0.011±0.007增加至0.276±0.039 2（P<0.01，n=6），并且同时通道开放时间明显延长，关闭时间明显缩短，通道开放水平增加，表明钙离子对该通道有明显的激活作用。
注：Em：+40mV，浴液钙离子浓度为2 mM。
3 讨 论
应用培养的神经细胞作为神经科学研究的工具已经是包括细胞功能，神经发育，退行性疾病等在内多领域，多层次研究的基本手段。而从细胞形态和电生理特性观察体外获得的神经元特征是判断细胞是否因培养条件改变特性，从而能否应用该细胞进行深入研究的前提。
3.1 取材对象和方法的选择 本实验采用出生24 h之内的SD乳鼠作为取材原料，采用机械吹打和低浓度、较长时间胰蛋白酶消化相结合的方法，经两次消化，可获得数量大，状态优，形状稳定的神经元。 一般来讲，胚胎神经元形态学分化与化学分化程度较低，体外存活能力强，且神经元之间的联系较少，易于成功培养[2，6]。但不同部位组织的培养及用于不同培养目的时其最佳胚龄也有不同，而这些对神经细胞的成活是至关重要的[7]。与选用胎龄为15～18 d的胎鼠神经元做体外培养相比，本实验应用的出生24 h之内的SD乳鼠不存在胎龄难以确定的问题。同时取材过程中采取的轻柔的机械消化与低浓度酶消化相结合的方法，对神经元损害小。
3.2 培养基的选择 神经细胞培养基主要有血清培养基和无血清培养基2种。前者可以提供神经细胞生长所必需的营养成分，促进细胞的增殖，但也为神经胶质细胞、成纤维细胞、神经干细胞、前体细胞等杂质细胞提供了丰富的营养，间接影响了神经元的纯度和生长。后者可抑制非神经元细胞的增殖，使神经元保持较好的细胞活性及生理特性[6，8]。然而无血清培养液如Neurobasal昂贵，不利于长期大量培养。本实验在接种时使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，保证神经元生长的营养供应。在接种后24 h加阿糖胞苷抑制非神经元的增殖，提高神经元的纯度。3 d后第一次换液时，全量换为含2%B27，10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，B27中含有神经元生长所必须的多种生长因子和微量元素，可以保证神经元长期健康生长所需营养。
3.3 原代培养乳鼠皮层神经元电生理特性 膜片钳技术广泛应用于神经细胞电生理研究，目前已成为一种常规方法。该技术的关键是需获得具有正常生理或病理特征，状态优良的细胞，且作为用于膜片钳实验的细胞，要求无污染，细胞状态良好，细胞膜光滑无杂质，通道蛋白表达正常[5]。在体外原代培养单个神经细胞，通过对其电生理特性的观察，可判断神经细胞是否因机械与化学法分离，或者因培养条件变化而改变了它的生理特性，从而考虑其能否用于药理及其他深入研究。源于：毕业小结www.618jyw.com
关键词：原代培养；皮层神经元；乳鼠；膜片钳；BKCa通道电流
1007-3612（2012）10-0042-05
A Modified Method for Primary Culture of Newborn Rat Cortical Neurons and Its Basic Electrophysiological Property
ZHAO Li， CHEN Yao， GONG Lijing， LU Yuanyuan
（Beijing Sport University， Beijing 100084， China）
Abstract：Objective：To modify previous method of primary newborn rat cortical neuron culture to get purer and more longlasting cells for som摘自：毕业论文结论范文www.618jyw.com
e related studies. Methods：The cerebral cortices were aseptically removed from 024 hold SD rats and dissected out. Mechanical dissociation and trypsin digestion were combined to conduct monocell suspending media. The dissociated momocortical cells were diluted to 1×105/ml then to be plated on poly Llysinecoated petri dish. After 24h culture， 3μg/mL cytosine arabinoside （AraC） was added to the culture for 24 h to inhibit the outgrowth of glial cells. After three days postplanted， all media were removed from cultures and replaced with medium supplemented with B27. Then half of the culture medium was changed every three days. The morphological changes of neuron cells were observed by light microscope. Immunostaining of microtubuleassociated protein 2 （MAP2） was applied to assess the culture purity. Single channel current was recorded to evaluate the neurons properties by using patch clamp technique. Results： The improved method could increase the cells lifetime. On the 36th day， the primary culture was characterized by normal morphology and was gained typical BKca current. Conclusion：This is a simple and reliable technique for the in vitro primary culture of rat cortical neurons which he longtime livability and normal electrophysiological property.
Key words：primary culture， cortical neurons， newborn rat， patch clamp， BKca current
原代培养神经细胞的生长发育特征与在体神经元非常相似，且具有样本均一性高，实验条件可控、相对恒定，影响因素单一，可有效排除诸多复杂因素（如体内循环、体液、内分泌、血脑屏障）等优点，日益成为神经科学研究中必不可少的实验材料及模型工具[1，2]。然而神经细胞培养与其他类型的细胞培养不同，正常神经细胞只能增大而不能增殖，即只能原代培养，不能传代，没有细胞分裂现象，随着培养时间的延长，神经细胞数只会减少，不可能增加。目前一般认为培养2～4周进行实验比较适宜，4周后细胞就开始退化[3]。而作为研究细胞电生理特性的膜片钳技术既要保证细胞形态特征的完好，又要保存其生理学特征，才能供研究使用[4]。本研究结合相关文献，对原有的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法进行改进，并采用膜片钳内面向外模式记录大电导钙激活钾通道（BKca）单通道电流，旨在建立一种简单、经济、体外存活时间较长且电生理特性正常的大鼠皮层神经元原代培养方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物 新生（< 24 h） SD大鼠，SPF级，由军事医学科学院动物中心提供。
1.2 试剂与溶液 EGTA，HEPES，L 多聚赖氨酸、阿糖胞苷、胰蛋白酶为Sigma公司产品；B-27 Supplement为Gibco公司产品；高糖DMEM，青霉素，链霉素为Hyclone公司产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；其他药品均为国产分析纯。
解剖液（mM）：10 HEPES， 135 NaCl， 5 KCl， 1.3 Na2HPO4.12H2O， 0.2 KH2PO4， 8.8 glucose，105 sucrose， 调节pH 至7.3，0.22 μm孔径滤膜过滤。DMEM完全培养液：89%高糖DMEM，10%胎牛血清，1%双抗（青霉素 （100 U/mL） ，链霉素 （100 U/mL），经0.22 μm孔径滤膜过滤。谷氨酰胺在使用前加入到培养基，终浓度为2 mM。DMEM/B27完全培养液：87%高糖DMEM，10%胎牛血清，2% B-27 Supplement，1%双抗（青霉素 （100 U/mL） ，链霉素 （100 U/mL） ），经0.22 μm孔径滤膜过滤。谷氨酰胺在使用前加入到培养基，终浓度为2 mM。电极内液（mM）：100 KCl，2 CaCl2，10 HEPES，用NaOH调 节pH至7.2-7.4，充灌前经0.22 μm滤膜进行过滤。细胞外液（mM）：40 KCl，0.55 CaCl2，1 EGTA，10 HEPES和10 glucose，用KOH调 节pH至7.2～7.4。使用前经0.22 μm滤膜进行过滤。
1.3 培养皿的预处理 包被L多聚赖氨酸： 培养神经元采用直径为35 mm的一次性塑料培养皿（NUNC），在培养前用终浓度为50 Lg/ mL的L多聚赖氨酸包被培养皿，置于超净工作台内（打开皿盖），紫外灯下照射2 h，回收多余液体。干燥后用DMEM冲洗两遍备用。
1.4 培养方法 取出生后24 h的SD大鼠，用去离子水冲洗体表后，于75%医用酒精中消毒，3～5 s后取出，移入超净工作台，在无菌环境下迅速取大脑，置于预冷的解剖液中。分离得到双侧皮层，用眼科镊剔除脑膜及血管，剪碎后转移到离心管内，并加入10倍体积的消化液（消化液为0.25%胰蛋白酶及解剖液（1∶1）的混合液），37℃水浴。采用二次消化的方法：每隔5 min轻晃离心管，使组织块与胰蛋白酶充分接触，10 min后用口径适宜且管口光滑的吸管轻轻吹打十几次，静置，取上清液于另一离心管，用含血清的DMED完全培养液终止消化，经200目尼龙滤网过滤获得单细胞悬液。剩余组织块加入适量消化液重复上述步骤。单细胞悬液 1 000 转/min 离心10 min，倒去上清液后，加DMEM完全培养液重悬，台酚蓝染色计数后，以1×105 的细胞密度接种于培养皿中，每皿2 mL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后加一次阿糖胞苷（3 μg/mL）以抑制非神经细胞过度增殖。培养基改进组在培养3 d后全量换为DMEM/B27完全培养液，之后每隔3 d半量换液；传统培养基组每隔源于：毕业论文指导记录www.618jyw.com
3 d半量换DMEM完全培养液。倒置相差显微镜（IX71-F22PH，Olympus，Japan）定期观察培养过程中细胞的生长情况。传统培养基组的神经元在培养至6 d时进行单通道BKCa通道电流的记录。培养基改进组培养至36 d时进行单通道BKCa通道电流记录。
1.5 大鼠大脑皮质神经元的形态学观察 细胞接种后定期在倒置相差显微镜下观察神经元生长的情况，并应用MAP2和Cy3免疫荧光双标染色，鉴定本方法培养的神经元。
1.6 BKCa通道电流的记录 实验在室温（20～25℃）下进行，将培养皿置于倒置相差显微镜载物台中。记录所用电极为薄壁硼硅玻璃电极毛细微管 （B15014F，ID：1.05 mm，OD：1.50 mm；Vital Sense Scientific Instruments，Wuhan），用电极拉制仪（PC10，Narishige，Tokyo） 两步拉制，经抛光仪 （MF-830，Narishige，Tokyo）抛光，电极尖端直径约为1.5 μm。实验采用膜片钳内面向外模式进行单通道记录，细胞内外液采用对称性高K+（140 mM）方式。玻璃微电极充灌电极内液后电阻为4～8 MΩ，给予电极一定正压，用微操纵器控制电极入液。当电极尖端接触细胞表面时，缓慢给与负压，即可见应答电流下降直至为零，表明高阻封接形成。待封接稳定，阻抗达10 GΩ以上，将电极提出液面，在空气中暴露数秒，再入液，即形成内面向外记录膜片。电流信号经膜片钳放大器 [Multiclamp 700B，Axon（（MDC）] 放大，1～2 kHz低通滤波，经模数/数模转换器[Digidata-1440A，Axon（MDC）] ，由pClamp10记录、储存于计算机。采样模式为Gap free，采样频率为2 kHz，8-极Bessel滤波1～3 kHz。
1.7 数据处理与分析 单通道数据经Clampfit10.2分析程序自动测量通道平均电流幅度（Am）、开放概率（Po）、平均开放时间（To）和 平均关闭时间（Tc）。经统计软件对数据及曲线拟合等做统计处理。
数据以均数±标准差表示。统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析，差异显著性为P<0.05，非常显著性为P<0.01。
2 结 果
2.1 神经细胞形态学观察 倒置相差显微镜观察：接种后24 h，细胞已贴壁，胞体较小，呈圆形或椭圆形，折光性良好，分布均匀，有1～2个突起，但细胞间连接较少。经MAP2和Cy3免疫荧光双标染色呈强阳性，荧光显微镜观察本方法培养的神经元纯度高达95%（图1）。图1 MAP2标记阳性神经元
培养3 d，细胞胞体增大较快，呈梭形或三角锥形，细胞间已形成稀疏的网络（图2A，图2 a）。培养6 d，神经细胞胞体增大，突起粗而长，有单极、双极、多极突起，细胞胞体饱满，光晕明显，已形成完整神经网络（图2B，图2b）。可见两组细胞在接种后前6 d细胞形态无显著性差异，但随着培养时间的逐步延长，采用传统DMEM完全培养液的神经元，在同一时间点，胞体较培养基改进组小，
图2 体外原代培养新生大鼠大脑皮层神经元光镜照片 400×
注：A，B，C，D分别为培养基改进组3 d，6 d，20 d，36 d的神经元。 a，b，c，d分别为传统培养基组3 d，6 d，20 d，28 d的神经元。
突起短，细，神经网络形成不明显，细胞出现退行性改变的时间早。如在培养20 d时，传统培养基组神经元出现细胞聚集成团，摘自：毕业论文翻译www.618jyw.com
神经元胞体内颗粒增多，突起减少、缩短，神经纤维退化等现象（图2 c），而培养基改进组在培养20 d时，细胞仍具有良好的光晕，致密的神经网络布满皿底（图2 C），在培养至36 d以后，神经元才逐渐出现胞体折光性降低，突起减少、缩短等退行性变化（图2 D）。而采用传统DMEM完全培养液基的神经元在培养至28 d时，已找不到形态完整的细胞（图2 d）。
2.2 原代培养大鼠皮层神经元BKCa单通道电流特性 原代培养皮层神经元细胞膜上的单通道电活动表现出明显的电压依赖性。随膜电位去极化程度增大，单通道电流幅值增大，开放概率显著增加。在对称性高钾（140 mM）溶液中，浴液游离钙浓度为2 μM时，内面向外膜片下记录的典型单通道电流（图3）。对培养36 d的培养基改进组神经元6个膜片的单通道电流进行统计后，绘制IV曲线，获取较大电导值（G）为（248.5±5.12）pS，反转电位接近0 mV。对培养6 d的传统培养基组神经元6个膜片的单通道电流进行统计后，绘制IV曲线，获取较大电导值（G）为（222.2±7.94）pS，反转电位接近0 mV。两组神经元BKCa通道的电导值并无显著性差异（P>0.05），且均符合BKCa通道大电导的特性[5]。
图3 大鼠皮层神经元BKCa通道电压依赖性图（A，a）和电导特性图（B，b）
注：采用内面向外单通道记录模式。在对称性高钾（140 mM）溶液中，浴液游离钙浓度为2 μM，IV曲线经线性拟合。
图3A、B为培养36 d的培养基改进组神经元BKCa通道特性图，图3ab为培养6 d的传统培养基组神经元BKCa通道特性图。
对培养36 d的培养基改进组神经元BKCa通道进行药理学鉴定：内面向外记录模式下，浴液钙离子浓度为2 mM时，形成内面向外记录模式后，将膜电位钳于+40 mV下，记录10 min，观察通道开放情况。如图4A所示 ，形成内面向外模式之初，通道开放频率很高，加入60 mmol/L钾通道特异性阻断剂四乙胺（TEA）后，通道开放在5 min后基本被阻断（图4B）。这种电流能被胞内较高浓度的钾通道阻断剂TEA所阻断，表明该通道电流为钾电流。
图4 TEA对培养36 d的培养基改进组神经元 BKCa通道的阻断作用
注：采用内面向外单通道记录模式。膜电位钳为+40 mV，浴液钙离子浓度为2 mM。A为加入TEA之前，B为加入60 mmol/L的TEA后5 min记录的电流。
在膜电位为+40 mV时，当浴液中钙离子浓度由0.1 mM增加至2 mM时，培养36 d的培养基改进组神经元BKCa通道开放概率由0.011±0.007增加至0.276±0.039 2（P<0.01，n=6），并且同时通道开放时间明显延长，关闭时间明显缩短，通道开放水平增加，表明钙离子对该通道有明显的激活作用。
注：Em：+40mV，浴液钙离子浓度为2 mM。
3 讨 论
应用培养的神经细胞作为神经科学研究的工具已经是包括细胞功能，神经发育，退行性疾病等在内多领域，多层次研究的基本手段。而从细胞形态和电生理特性观察体外获得的神经元特征是判断细胞是否因培养条件改变特性，从而能否应用该细胞进行深入研究的前提。
3.1 取材对象和方法的选择 本实验采用出生24 h之内的SD乳鼠作为取材原料，采用机械吹打和低浓度、较长时间胰蛋白酶消化相结合的方法，经两次消化，可获得数量大，状态优，形状稳定的神经元。 一般来讲，胚胎神经元形态学分化与化学分化程度较低，体外存活能力强，且神经元之间的联系较少，易于成功培养[2，6]。但不同部位组织的培养及用于不同培养目的时其最佳胚龄也有不同，而这些对神经细胞的成活是至关重要的[7]。与选用胎龄为15～18 d的胎鼠神经元做体外培养相比，本实验应用的出生24 h之内的SD乳鼠不存在胎龄难以确定的问题。同时取材过程中采取的轻柔的机械消化与低浓度酶消化相结合的方法，对神经元损害小。
3.2 培养基的选择 神经细胞培养基主要有血清培养基和无血清培养基2种。前者可以提供神经细胞生长所必需的营养成分，促进细胞的增殖，但也为神经胶质细胞、成纤维细胞、神经干细胞、前体细胞等杂质细胞提供了丰富的营养，间接影响了神经元的纯度和生长。后者可抑制非神经元细胞的增殖，使神经元保持较好的细胞活性及生理特性[6，8]。然而无血清培养液如Neurobasal昂贵，不利于长期大量培养。本实验在接种时使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，保证神经元生长的营养供应。在接种后24 h加阿糖胞苷抑制非神经元的增殖，提高神经元的纯度。3 d后第一次换液时，全量换为含2%B27，10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，B27中含有神经元生长所必须的多种生长因子和微量元素，可以保证神经元长期健康生长所需营养。
3.3 原代培养乳鼠皮层神经元电生理特性 膜片钳技术广泛应用于神经细胞电生理研究，目前已成为一种常规方法。该技术的关键是需获得具有正常生理或病理特征，状态优良的细胞，且作为用于膜片钳实验的细胞，要求无污染，细胞状态良好，细胞膜光滑无杂质，通道蛋白表达正常[5]。在体外原代培养单个神经细胞，通过对其电生理特性的观察，可判断神经细胞是否因机械与化学法分离，或者因培养条件变化而改变了它的生理特性，从而考虑其能否用于药理及其他深入研究。源于：毕业小结www.618jyw.com
发表评论
共有3000条评论 快来参与吧~